12.08.2016 – Kategorie: Technik

Optik: Verbesserte 3D-Auflösung in der Fluoreszenzmikroskopie

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Das gleichzeitige Erfassen von drei Ansichten eines Präparats führt zu detaillierteren Einsichten in den Aufbau und die Prozesse in Bakterien und lebenden Zellen. Das neue Verfahren könnte sich als besonders nützlich Analysen dynamischer biologischer Abläufe erweisen, die zeigen, wie gesunde Zellen arbeiten und was bei Krankheiten passiert.

Das gleichzeitige Erfassen von drei Ansichten eines Präparats führt zu detaillierteren Einsichten in den Aufbau und die Prozesse in Bakterien und lebenden Zellen. Das neue Verfahren könnte sich als besonders nützlich Analysen dynamischer biologischer Abläufe erweisen, die zeigen, wie gesunde Zellen arbeiten und was bei Krankheiten passiert.

Im Journal von The Optical Society, Optica, stellen die Forscher dieses Multi-View-Konzept in zwei mikroskopischen Modi vor und verwenden unterschiedliche Typen biologischer Präparate. Für beide Modi konnten sie eine volumetrische Auflösung bis zu 235 x 235 x 340 Nanometer zeigen und damit die volumetrische Auflösung herkömmlicher Verfahren verdoppeln.

Biologen nutzen üblicherweise die Fluoreszenzmikroskopie, um alles im weiten Feld von der Entwicklung von Embryonen bis hin zu komplexen Abläufen in lebenden Zellen zu studieren. Doch die meisten derartigen Verfahren scheitern daran, viel von der Fluoreszenz des Präparats zu erfassen, was nicht nur verlorene Information bedeutet, sondern auch die Bildauflösung reduziert.  

„Bei unserer Arbeit haben wir die früher vernachlässigte Fluoreszenz erfasst und das mit den traditionellen Darstellungsformen der konventionellen Mikroskopie verschmolzen“, sagt Yicon Wu, Wissenschaftler am National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering, National Institutes of Health, Maryland, USA, und Hauptautor des Papers. Dies würde die Auflösung verbessern ohne dabei Abstriche an der zeitlichen Auflösung machen zu müssen oder das Präparat zusätzlich zu beleuchten.

Eine dritte Linse

Der neue Ansatz verbessert ein bereits eingesetztes Verfahren der Lichtscheibenfluoreszenzmikroskopie namens Dual-view Plane Illumination Microscopy (diSPIM) mit zwei Objekten und einer dünnen Lichtscheibe, um die Fluoreszenz aufzunehmen bzw. anzuregen.

Wie Hari Shroff, Leiter des Forscherteams erklärt, sei die Hauptmotivation für den neuen Ansatz die durch die numerische Apertur der oberen Linsen beschränkte Auflösung gewesen, und die in Richtung des Deckglases emittierte Fluoreszenz sei so nicht erfasst worden. Durch Erfassen dieses Signals mit einer Linse höherer numerischer Apertur, die die Unteransicht liefert, hätte man die laterale Auflösung verbessern können, so der Gedanke.

In der verbesserten Anordnung ist die Lichtscheibe jeweils im 45-Grad-Winkel relativ zur zusätzlichen unteren Objektivlinse geneigt. Die Wissenschaftler führten die Fokalebene des unteren Objektivs durch das Präparat, um die vorher ungenutzte Fluoreszenz aufzufangen, doch dieses mechanische Scannen könnte in zukünftigen Versionen des Mikroskops durch eine passive Optik ersetzt werden. Durch das Verfahren ließ sich die laterale oder horizontale Auflösung von diSPIM auf etwas 235 nm steigern.

Durch das Scannen der drei Objektive durch das Präparat konnten im Wide-Field-Modus drei individuelle 3D-Ansichten gewonnen werden. Die Auflösung in der Z-Achse wurde auf rund 340 nm verbessert.

Drei Ansichten zu einer machen

Ob mi Wide-Field- oder Lichtscheibenmodus, die drei Ansichten gilt es, präzise anzuordnen und mit einer Bildverarbeitungstechnik zu säubern, die als Dekonvolution bekannt ist. Dabei hat es sich als hilfreich erwiesen, zunächst jedes Bild zu dekonvoluieren, um Bildqualität oder Kontrast zu verbessern. Das erlaubte dann das passgenaue Registrieren aller drei Ansichten. Im Wide-Field-Modus kamen fluoreszierende Marker an den Präparaten als Referenzpunkte zum Einsatz.

Die Wissenschaftler haben das Multi-View-Verfahren bei der Darstellung biologischer Präparate eingesetzt und konnten Merkmale im Detail erkennen, die sonst üblicherweise nicht beobachtbar wären. So konnte das Mikroskop im Wide-Field-Modus die sphärische Proteinhülle, die vorhanden ist, wenn Bacillus subtilis Sporen ausbildet, klar darstellen, und es ermöglichte den Forschern, die Dynamik der Organellen im Inneren von Zellen zu sehen. Im Lichtscheiben-Modus ließ sich in 40 Minuten mit 150 Bildern aus jeweils 3 Ansichten die dynamische Natur der winzigen Auswölbungen an lebenden weißen Blutkörperchen feststellen. Die neue Methode verbessert die räumliche Auflösung ohne zusätzliche Lichtquellen oder Abstrichen an der zeitlichen Auflösung im Vergleich zu konventionellen Verfahren. Denn zusätzliches Licht kann die lebenden Zellen schädigen oder sie sogar töten und die hohe zeitliche Auflösung braucht es, um schnelle Prozesse zu erfassen.

Das Entwicklerteam erkundet für das System nun weitere Anwendungen in der Biologie und arbeitet daran, die Methode auf andere mikroskopische Techniken, wie die konfokale Mikroskopie auszuweiten.

 

Paper: Y. Wu, P. Chandris, P.W. Winter, E.Y. Kim, V. Jaumouillé, A. Kumar, M. Guo, J.M. Leung, C. Smith, I. Rey-Suarez, H. Liu, C.M. Waterman, K.S. Ramamurthi, P. LaRiviere, H. Shroff, „Simultaneous multi-view capture and fusion improves spatial resolution in wide-field and light-sheet microscopy,“ Optica, 3, 8, 897 (2016). DOI: 10.1364/optica.3.000897.

 

Bild: 

Mit einer dritten Linse konnten die Wissenschaftler früher vernachlässigte Fluoreszenz erfassen und damit die Bildqualität in 3D verbessern. Die schematische Darstellung zeigt, wie das Konzept für eine Form der Lichtscheibenfluoreszenzmikroskopie angewandt wird. 

CREDIT

Yicong Wu, National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering


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